嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條性能評(píng)估測(cè)試

      摘要：對(duì)上海飛測(cè)生物科技有限公司研發(fā)生產(chǎn)的嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條在糧食谷物飼料中的檢測(cè)性能進(jìn)行了評(píng)估。該產(chǎn)品的檢出限為25μg/kg，最低定量限為82μg/kg，線性范圍為100-5000μg/kg，線性范圍內(nèi)的添加回收率為83.51%~113.84%，同一個(gè)樣本的檢測(cè)3次的CV<14.75%，與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于5%，與其代謝物的交叉反應(yīng)率在20%以內(nèi)。該產(chǎn)品具有操作簡(jiǎn)便、靈敏準(zhǔn)確、快速定量、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，適合用于對(duì)糧食谷物飼料中嘔吐毒素的進(jìn)行快速定量測(cè)定。

      關(guān)鍵詞：嘔吐毒素快速定量檢測(cè)；熒光定量免疫層析；嘔吐毒素；糧食谷物飼料

嘔吐毒素主體成分為DON（deoxynivalenol,脫氧雪腐鐮刀菌烯醇），屬于單端孢霉烯族化合物，主要由禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、粉紅鐮刀菌、雪腐鐮刀菌等鐮刀菌產(chǎn)生。另外，頭孢菌屬、漆班菌屬、木霉屬等菌株都可產(chǎn)生該毒素。單端孢霉烯族毒素共有150多種，是一類強(qiáng)有力免疫抑制劑，所引起典型癥狀是采食量降低，所以這類毒素又叫飼料拒食毒素。嘔吐毒素（DON）是其中最重要一種毒素，主要來自鐮刀菌屬（Fusarium），尤其是禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum）和黃色鐮刀菌（Fusariumculmorum）。由于它可以引起豬的嘔吐，故又名嘔吐毒素（vomitoxin，VT）。

該毒素最早于1970年在日本香川縣的一次赤霉病大麥中毒的病毒中發(fā)現(xiàn)，1972年，由日本的Morooka等首次從赤霉病大麥中分離，Yoshizawa等闡明了這種新的真菌毒素的結(jié)構(gòu)，并將其命名為4-deoxynivalenol（DON）。1973年Vesonder等在美國從被鐮刀菌污染的玉米中分離出了同樣的化學(xué)物質(zhì)，因?yàn)樵摲N物質(zhì)可以引起豬產(chǎn)生嘔吐癥狀，故命名為嘔吐毒素，并相繼發(fā)現(xiàn)可以在赤霉病大麥、被鐮刀菌污染的玉米中分離出該物質(zhì)。嘔吐毒素是食品中常見的真菌毒素，在自然界中廣泛存在，通常在歐洲及北美發(fā)現(xiàn)的3種毒素是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。由于它們具有很高的細(xì)胞毒素及免疫抑制性質(zhì)，因此，對(duì)人類及動(dòng)物的健康構(gòu)成了威脅，特別是對(duì)免疫功能具有明顯的影響。根據(jù)DON的劑量和暴露時(shí)間不同可引起免疫抑制或免疫刺激。當(dāng)人攝入了被DON污染的食物后，會(huì)導(dǎo)致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)損害造血系統(tǒng)造成死亡。由于中國傳統(tǒng)飲食習(xí)慣中糧谷比例大大高于西方，使得嘔吐毒素的危害更為突出。1998年，在國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的評(píng)價(jià)報(bào)告中，嘔吐毒素被列為3類致癌物。歐盟要求嘔吐毒素要小于1.0mg/kg；中國谷物飼料中要求嘔吐毒素的含量低于低于1 .0mg/kg，飼料中低于5 mg/kg。

目前，國標(biāo)法測(cè)定嘔吐毒素需要大型的儀器設(shè)備，價(jià)格昂貴，操作過程復(fù)雜、時(shí)間較長(zhǎng)，且無法在現(xiàn)場(chǎng)和基礎(chǔ)小型實(shí)驗(yàn)室使用。除此之外，也有采用嘔吐毒素酶聯(lián)免疫試劑盒或膠體金快速檢測(cè)試紙條用于大量樣品的篩查，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速，成本也較低，但準(zhǔn)確性和重復(fù)性較差，容易造成假陽性或者假陰性。因此，急需一種既簡(jiǎn)便快速，又能準(zhǔn)確定量的檢測(cè)方法，熒光定量免疫層析正好可以滿足這種需求。本文通過對(duì)多種糧食谷物飼料樣品的實(shí)測(cè)，驗(yàn)證了上海飛測(cè)生物開發(fā)的嘔吐毒素?zé)晒舛靠焖贆z測(cè)試紙條的技術(shù)性能。

1實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1試劑和材料

除注明外，均為分析純，試驗(yàn)用水均為UP水。

熒光熒光定量檢測(cè)試紙條（由包被有熒光微球標(biāo)記嘔吐毒素抗體的乳膠墊、噴涂有嘔吐毒素抗原的檢測(cè)線和噴涂有羊抗雞二抗的控制線的NC膜、樣品墊及吸收墊組成）、樣品提取液、樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)曲線ID卡及標(biāo)準(zhǔn)曲線條形碼均由上海飛測(cè)生物科技有限公司提供。

嘔吐毒素及其他真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品：購自Sigma公司；

大米、玉米、小麥、面粉等樣品從超市購得或從企業(yè)取樣。

麩皮，小麥、面粉等飼料樣品從飼料廠和企業(yè)取樣。

1.2儀器與設(shè)備

FD-100型熒光免疫定量分析儀和FD-5000型試紙條恒溫孵育器，上海飛測(cè)生物科技有限公司提供；低速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；漩渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子天平：Sartorius；

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1樣品的前處理

取具有代表性的待測(cè)樣品500g，用小型粉碎機(jī)粉碎1min后過20目篩，收集過篩的細(xì)小樣品。稱取1.0±0.02g過篩的樣品于10mL離心管中，加入5mL提取液，用漩渦混勻儀震蕩5min(或者搖床振蕩10min）后，4000RPM離心1min，取上清。

1.3.2檢測(cè)過程

取50μL離心上清液加入500μL樣品稀釋液中，用漩渦混勻器混勻3-5s，然后取100μL加入到嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條的加樣孔中，置于37℃恒溫孵育器中溫育10min后，將試紙條插入熒光免疫定量分析儀中讀數(shù)，即為樣品的實(shí)際檢測(cè)濃度。當(dāng)檢測(cè)值大于5000μg/kg時(shí)，可用提取液將離心上清液稀釋5倍后再進(jìn)行檢測(cè)，所得讀數(shù)值乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為最終的檢驗(yàn)結(jié)果。

2檢測(cè)結(jié)果分析

2.1線性范圍與檢出限

取7個(gè)無污染（陰性）小麥樣品和7個(gè)無污染（陰性）玉米樣品，分別添加100μg/kg、250μg/kg、500μg/kg、1000μg/kg、2500μg/kg、5000μg/kg 的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用上海飛測(cè)生物嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條每個(gè)樣品檢測(cè)3次，以添加濃度為為縱坐標(biāo)，以熒光定量檢測(cè)試紙條的檢測(cè)結(jié)果為橫坐標(biāo)，擬合曲線并計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如下：

圖1 小麥中嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品添加與熒光定量試紙條檢測(cè)值的線性關(guān)系

圖2 玉米中嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品添加與熒光定量試紙條檢測(cè)值的線性關(guān)系

計(jì)算得出小麥的線性范圍：100～5000μg/kg（6點(diǎn)）， 回歸方程: y = 0.981x + 60.52，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.997；玉米的線性范圍：100～5000μg/kg（6點(diǎn)）， 回歸方程: y = 0.976x + 52.00，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.998；（見圖1和圖2）。

取10個(gè)無污染（陰性）小麥樣品和10個(gè)無污染（陰性）玉米樣品，用上海飛測(cè)生物嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條每個(gè)樣品檢測(cè)3次，檢測(cè)限（LOD）為測(cè)定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，定量限(LOQ)為測(cè)定平均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。測(cè)試結(jié)果表明，DON的LOD為25μg/kg，LOQ為82μg/kg。

2.2準(zhǔn)確性和重復(fù)性分析

在用國標(biāo)法測(cè)定為0的空白樣品中分別添加嘔吐毒素總量為100，250，500，1000，2000，5000μg/kg，然后按照嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1  不同樣本檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性

從表1可以看出，上海飛測(cè)生物科技有限公司所生產(chǎn)的嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條測(cè)試不同糧食谷物中嘔吐毒素的添加回收率在83.51%~113.84%，3次重復(fù)的變異系數(shù)在14.75%以內(nèi)。
      2.3與色譜方法的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

大米、小麥、玉米、面粉、麩皮、噴漿玉米、大豆、豆粕各1份共24個(gè)樣本，先采用國標(biāo)液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，再使用上海飛測(cè)生物科技有限公司所生產(chǎn)的嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條進(jìn)行測(cè)定，各測(cè)試3個(gè)平行樣。檢測(cè)結(jié)果如下：

表2  與液相色譜法結(jié)果比對(duì)（μg/kg）

表2表明，在不同的糧食谷物飼料中，上海飛測(cè)生物科技有限公司所生產(chǎn)的嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條與液相色譜法的符合率為102.00%~110.85%，3次重復(fù)測(cè)定的的CV值在8.84%以內(nèi)。

      2.4方法特異性

選擇 DON結(jié)構(gòu)類似物和其他5種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品在陰性玉米中進(jìn)行添加，添加的濃度為1000 μg/kg，然后用飛測(cè)生物嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)樣品測(cè)3次取平均值；結(jié)果顯示與赭曲霉毒素A，伏馬菌素B1，黃曲霉毒素B1、T-2毒素、玉米赤霉烯酮交叉反應(yīng)率均＜5%，與其代謝物、結(jié)構(gòu)類似物有一定的交叉反應(yīng)（＜20%）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，嘔吐毒素膠體金試劑條對(duì)伏馬毒素、赭曲霉毒素、黃曲霉毒素、玉米赤霉毒素幾乎無交叉反應(yīng)，其方法特異性可以能滿足檢測(cè)要求。

表3 交叉反應(yīng)率表

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用上海飛測(cè)生物科技有限公司所生產(chǎn)的嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測(cè)試紙條對(duì)不同的糧食谷物飼料樣本進(jìn)行測(cè)試，該產(chǎn)品的檢出限為25μg/kg，最低定量限為82μg/kg，線性范圍為100-5000μg/kg，線性范圍內(nèi)的添加回收率為83.51%~113.84%，同一個(gè)樣本的檢測(cè)3個(gè)樣本的CV<14.75%，與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于5%，與其代謝物的交叉反應(yīng)率在20%以內(nèi)。其準(zhǔn)確性和可靠性均可以滿足歐盟和我國對(duì)嘔吐毒素的分析標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求。該方法具有簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好等特點(diǎn)，可用于不同糧食谷物飼料中嘔吐毒素的快速定量檢測(cè)分析。

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