玉米赤霉烯酮熒光定量檢測試紙條性能評估測試

      摘要：對上海飛測生物科技有限公司研發(fā)生產(chǎn)的玉米赤霉烯酮熒光定量檢測試紙條在糧食谷物飼料中的檢測性能進行了評估。該產(chǎn)品的最低檢出限（LOD）為0.29μg/kg，最低定量限(LOQ)為0.91μg/kg，線性范圍為1.00-50.00μg/kg，線性范圍內(nèi)的添加回收率為92.89%~121.07%，3次重復的變異系數(shù)在14.56%以內(nèi)。與其他真菌毒素的交叉反應率均小于5%。該產(chǎn)品具有操作簡便、靈敏準確、快速定量、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，適合用于對糧食谷物飼料中玉米赤霉烯酮的進行快速定量測定。

      關鍵詞：玉米赤霉烯酮檢測試紙條；熒光定量免疫層析；玉米赤霉烯酮；糧食谷物飼料

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)又稱F-2毒素，主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生。它首先從有赤霉病的玉米中分離得到，是一種酚的二羥基苯酸的內(nèi)酯結構，分子式為C18H22O5。玉米赤霉烯酮常污染玉米小麥、大米、大麥、小米和燕麥等谷物。玉米赤霉烯酮具有雌激素的作用，其強度為雌激素的十分之一，可造成家禽和家畜的雌激素水平提高。目前發(fā)現(xiàn)，豬對此毒素較為敏感。玉米赤霉烯酮作用的靶器官主要是雌性動物的生殖系統(tǒng)，同時對雄性動物也有一定的影響，可使家畜，家禽和實驗小鼠產(chǎn)生雌性激素亢進癥。妊娠期的動物(包括人)食用含玉米赤霉烯酮的食物可引起流產(chǎn)、死胎和畸胎。由于玉米赤霉烯酮具有以上危害，已經(jīng)被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）確定為最危險的自然發(fā)生的食品污染物之一。我國國家標準GB 2761-2011（食品中真菌毒素限量）中對谷物及其制品中的ZEN最高限量要求為60μg/kg。GB 13078.2-2006 《飼料衛(wèi)生標準 飼料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允許量》，不同種類的飼料中玉米赤霉烯酮的最高限量標準為500μg/kg

目前，國標法測定玉米赤霉烯酮采用HPLC法，需要大型的儀器設備，價格昂貴，操作過程復雜、時間較長，且無法在現(xiàn)場和基礎小型實驗室使用。除此之外，也有采用玉米赤霉烯酮酶聯(lián)免疫試劑盒或膠體金快速檢測試紙條用于大量樣品的篩查，操作簡便，檢測快速，成本也較低，但準確性和重復性較差，容易造成假陽性或者假陰性。因此，急需一種既簡便快速，又能準確定量的檢測方法，熒光定量免疫層析正好可以滿足這種需求。本文通過對多種糧食谷物飼料樣品的實測，驗證了上海飛測生物開發(fā)的玉米赤霉烯酮熒光定量快速檢測試紙條的技術性能。

1實驗材料和方法

1.1試劑和材料

除注明外，均為分析純，試驗用水均為UP水。

玉米赤霉烯酮熒光熒光定量檢測試紙條（由包被有熒光微球標記玉米赤霉烯酮抗體的乳膠墊、噴涂有玉米赤霉烯酮抗原的檢測線和噴涂有羊抗雞二抗的控制線的NC膜、樣品墊及吸收墊組成）、樣品提取液、樣品稀釋液、標準曲線ID卡及標準曲線條形碼均由上海飛測生物科技有限公司提供。

玉米赤霉烯酮及其他真菌毒素的標準品：購自Sigma公司；

大米、玉米、小麥、面粉等樣品從超市購得或從企業(yè)取樣。

麩皮，小麥、面粉等飼料樣品從飼料廠和企業(yè)取樣。

1.2儀器與設備

FD-100型熒光免疫定量分析儀和FD-5000型試紙條恒溫孵育器，上海飛測生物科技有限公司提供；低速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；漩渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子天平：Sartorius；

1.3試驗方法

1.3.1樣品的前處理

取具有代表性的待測樣品500g，用小型粉碎機粉碎1min后過20目篩，收集過篩的細小樣品。稱取1.0±0.02g過篩的樣品于10mL離心管中，加入5mL提取液，用漩渦混勻儀震蕩5min(或者搖床振蕩10min）后，4000RPM離心1min，取上清。

1.3.2檢測過程

取50μL離心上清液加入500μL樣品稀釋液中，用漩渦混勻器混勻3-5s，然后取100μL加入到玉米赤霉烯酮熒光定量檢測試紙條的加樣孔中，置于37℃恒溫孵育器中溫育10min后，將試紙條插入熒光免疫定量分析儀中讀數(shù)，即為樣品的實際檢測濃度。當檢測值大于5000μg/kg時，可用提取液將離心上清液稀釋5倍后再進行檢測，所得讀數(shù)值乘以對應的稀釋倍數(shù)即為最終的檢驗結果。

2檢測結果分析

2.1線性范圍與檢出限

在樣品提取液中，分別添加10.00μg/kg、25.00μg/kg、50.00μg/kg、100.00μg/kg、250.00μg/kg、500.00μg/kg 、1000μg/kg的玉米赤霉烯酮標準品，用上海飛測生物玉米赤霉烯酮熒光定量檢測試紙條每個樣品檢測3次，以添加濃度為為縱坐標，以熒光定量檢測試紙條的檢測結果為橫坐標，擬合曲線并計算線性相關系數(shù)，結果如下：

圖1 玉米赤霉烯酮標準品添加與熒光定量試紙條檢測值的線性關系

計算得出小麥的線性范圍：10.00～1000.00μg/kg（7點）， 回歸方程: y = 1.107x + 0.011，相關系數(shù)，R2 = 0.998；（見圖1）。

取10個無污染（陰性）小麥樣品和10個無污染（陰性）玉米樣品，用上海飛測生物玉米赤霉烯酮熒光定量檢測試紙條每個樣品檢測3次，檢測限（LOD）為測定平均值加3倍標準偏差，定量限(LOQ)為測定平均值加10倍標準偏差。測試結果表明，玉米赤霉烯酮熒光定量檢測試紙條的LOD為3.65μg/kg，LOQ為8.51μg/kg。

2.2準確性和重復性分析

在用國標法測定為0的不同種類空白樣品中分別添加玉米赤霉烯酮濃度為1.00，2.50，5.00，10.00，25.00，50.00μg/kg的標準品，然后按照玉米赤霉烯酮熒光定量檢測試紙條的檢測方法進行檢測。檢測結果見表1。

表1  不同樣本檢測的準確性和重復性

從表1可以看出，上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的玉米赤霉烯酮熒光定量檢測試紙條測試不同糧食谷物中玉米赤霉烯酮的添加回收率在94.00%~118.33%，3次重復的變異系數(shù)在13.11%以內(nèi)。
      2.3與色譜方法的對比試驗結果

取大米、小麥、玉米、高粱、花生、麩皮、噴漿玉米、DDGS、豆粕受污染樣品各1份，先采用國標液相色譜法進行測定，再使用上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的玉米赤霉烯酮熒光定量檢測試紙條進行測定，各測試3個平行樣。檢測結果如下：

表3  玉米赤霉烯酮熒光定量檢測卡與高效液相色譜法檢測值對比

表2表明，在不同的糧食谷物飼料中，上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的玉米赤霉烯酮熒光定量檢測試紙條與液相色譜法的符合率為99.66%~111.87%，3次重復測定的的CV值在13.68%以內(nèi)。

      2.4方法特異性

選擇其他5種常見的真菌毒素的標準品在陰性玉米中進行添加，添加的濃度為1000 μg/kg，然后用飛測生物玉米赤霉烯酮熒光定量檢測試紙條進行測試，每個樣品測3次取平均值；結果顯示與赭曲霉毒素A，伏馬菌素B1，嘔吐毒素、T-2毒素、黃曲霉毒素B1交叉反應率均＜5%。實驗結果表明，玉米赤霉烯酮熒光定量檢測試紙條對伏馬毒素、赭曲霉毒素、嘔吐毒素、黃曲霉毒素B1幾乎無交叉反應，其方法特異性可以能滿足檢測要求。

表3 交叉反應率表

3結論

本實驗采用上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的玉米赤霉烯酮熒光定量檢測試紙條對不同的糧食谷物飼料樣本進行測試，該產(chǎn)品的最低檢出限LOD為3.65μg/kg，最低定量限LOQ為8.51μg/kg，線性范圍為10.00-1000.00μg/kg，線性范圍內(nèi)的添加回收率為94.00%~118.33%，3次重復的變異系數(shù)在13.11%以內(nèi)。與其他真菌毒素的交叉反應率均小于5%。其準確性和可靠性均可以滿足歐盟和我國對玉米赤霉烯酮的分析標準的技術要求。該方法具有簡便快速、準確可靠、重復性好等特點，可用于不同糧食谷物飼料中玉米赤霉烯酮的快速定量檢測分析。

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